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链霉菌769胆固醇氧化酶毒力分析及其提高球孢白僵菌毒力研究

               
【摘要】:胆固醇氧化酶(Cholesterol oxidase),是胆固醇降解代谢过程中的关键酶。研究发现,胆固醇氧化酶可使多种鳞翅目及鞘翅目昆虫内消化道的上皮细胞破裂,从而抑制昆虫的生长发育,被认为是一种非常有效的生物杀虫剂。国外学者已经将胆固醇氧化酶基因在烟草(Nicotiana tabacum)中进行了验证,获得了对鳞翅目及鞘翅目昆虫均具有较强杀虫能力的转基因植株,同时发现转胆固醇氧化酶基因烟草组织对棉铃象甲幼虫具有高达87%的致死率,并严重迟缓棉铃象甲幼虫发育进程。球孢白僵菌[Beauveria bassiana(Bals.-Criv.)Vuill.]是一种应用非常广泛的微生物真菌,具有寄主范围广、防治效果好、无毒和不污染环境等优点。但该生防真菌致病周期长,杀虫速度总难尽如人意,这一直是影响球孢白僵菌进一步应用推广的重要因素,也是国内外试图重点攻关解决的技术难题。利用基因工程技术将毒力基因导入球孢白僵菌中,提高球孢白僵菌的致病能力,是目前高效菌株开发的主要手段之一,已成为该领域研究的热点。目前,尚未见到利用对害虫血腔有破坏作用的毒力因子提高虫生真菌毒力的研究报道。本研究利用前期纯化得到的具有较高酶活性的链霉菌769(Streptomyces ahygroscopicus769)胆固醇氧化酶重组蛋白,通过室内毒力分析测定该蛋白对吉林省玉米主要害虫——亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis Guenee)的毒性;采用透射电镜观察重组蛋白对亚洲玉米螟中肠组织的病理变化;利用PEG介导的原生质体的遗传转化方法将胆固醇氧化酶基因导入球孢白僵菌;通过酶活性测定比较不同转化子基因表达差异;采用室内毒力分析比较不同转化子毒力提高程度。具体结果如下。(1)采用注射法测定重组蛋白对亚洲玉米螟3龄幼虫的毒力。结果表明,在注射后2天,几乎所有的实验组幼虫虫体表面颜色都变深,而对照组虫体颜色没有发生变化。重组蛋白对亚洲玉米螟有着很强的毒性,致死率与注射的蛋白浓度呈正相关。经计算重组蛋白对亚洲玉米螟的LC_(50)为27.4μg/mL,该发现增大了胆固醇氧化酶的杀虫谱。(2)通过透射扫描电镜观察发现,注射重组蛋白的亚洲玉米螟幼虫中肠细胞微绒毛发生大量脱落,细胞核染色质减少,内质网肿胀断裂,杯状细胞微绒毛也出现明显的脱落,且病变程度随时间的增加而加剧。(3)利用原生质体转化技术将胆固醇氧化酶基因导入球孢白僵菌中,通过对转化子进行PCR和RT-PCR鉴定,获得了5株阳性转化子。(4)对不同转化子进行胆固醇氧化酶活性测定,选出了3株具有较高酶活性的转化子,这3株转化子均表现出相似的酶活力,并都高于出发菌株BbOFDH1-5。我们对二者酶活力进行了对比分析,发现3株转基因菌株的平均最高酶活是出发菌株的3.74倍。即使在诱导的初始阶段(12h),二者酶活力差值为最小值时,转化子的平均酶活也是出发菌株的2.6倍。(5)采用浸渍法比较转化子与出发菌株对亚洲玉米螟毒力,在供试的3个转化子中,转化子3号和8号毒力较出发菌株BbOFDH1-5显著增强,而转化子7号毒力较出发菌株弱。综上所述,链霉菌769胆固醇化氧化酶对亚洲玉米螟具有较高毒性,很可能通过破坏亚洲玉米螟中肠细胞相关膜系统,从而发挥毒性。此外,链霉菌769胆固醇化氧化酶能显著提高球孢白僵菌毒力,因而该酶是一种具有重要应用前景的杀虫毒力蛋白。同时本研究还为球孢白僵菌基因工程改良提供了一个新的思路。
【作者单位】:
【基金】:
【分类号】:S476.1

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1 佟雨航;[D];吉林农业大学;2015年
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